PPI a ryzyko sercowo-naczyniowe: mechanizm hamowania DDAH1

Czy stosowanie PPI niesie ukryte ryzyko dla układu naczyniowego?

Inhibitory pompy protonowej (PPI) są powszechnie stosowanymi lekami w leczeniu schorzeń żołądkowo-przełykowych, takich jak niestrawność, dyspepsja, przełyk Barretta i zespół Zollingera-Ellisona. Choć są one skuteczne w leczeniu tych schorzeń, długotrwałe stosowanie PPI wiąże się z ryzykiem wystąpienia złamań osteoporotycznych oraz niskim poziomem magnezu we krwi. Najnowsze badania farmakoepidemiologiczne wskazują ponadto, że przewlekłe stosowanie PPI, szczególnie u osób starszych, może zwiększać ryzyko demencji, niewydolności nerek oraz poważnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, takich jak udar mózgu i zawał serca. Jednak do tej pory nie zidentyfikowano jednolitego mechanizmu odpowiedzialnego za te potencjalnie szkodliwe działania PPI.

Niedawno naukowcy odkryli, że PPI hamują aktywność enzymatyczną dimetyloargininodimetyloaminohydrolazy 1 (DDAH1) – enzymu sercowo-naczyniowego, oraz zwiększają poziom jego substratu, asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) w osoczu, co prowadzi do upośledzenia funkcji naczyniowej w modelach ex-vivo i zwierzęcych. DDAH1 to hydrolaza cysteinowa o masie 31 kDa, która występuje w głównych typach komórek układu nerkowego, sercowo-naczyniowego i ośrodkowego układu nerwowego. Enzym ten może występować w postaci wolnej (apo-DDAH1) oraz związanej z cynkiem (Zn²⁺; holo-DDAH1). Chociaż Zn²⁺ nie jest bezpośrednio zaangażowany w aktywność enzymatyczną, uczestniczy w stabilizacji enzymu w różnych warunkach temperatury i pH. Struktura DDAH1 pokazuje, że miejsce aktywne składa się z wysoce konserwatywnych reszt aminokwasowych Asp126, His172 i Cys273, tworzących triadę katalityczną.

ADMA jest analogiem aminokwasu L-argininy, który powstaje w wyniku metylacji białek komórkowych przez rodzinę enzymów znanych jako metylotransferazy argininowe białek (PRMT). Wolna ADMA jest endogennym inhibitorem wszystkich trzech izoform syntazy tlenku azotu (NOS): neuronalnej NOS (nNOS lub typ I), indukowalnej NOS (iNOS lub typ II) i śródbłonkowej NOS (eNOS lub typ III). Około 80% ADMA jest metabolizowane przez DDAH1 do dimetyloaminy i cytruliny, podczas gdy pozostałe 20% jest wydalane przez układ nerkowy. W obecności czynników ryzyka sercowo-naczyniowego (np. dysfunkcji naczyniowej), stresu oksydacyjnego lub ekspozycji na leki, które upośledzają ekspresję lub aktywność DDAH, krążący i tkankowy poziom ADMA może wzrosnąć powyżej poziomów fizjologicznych. Podwyższony poziom ADMA w osoczu zwiększa ryzyko chorób sercowo-naczyniowych i zgonu.

Jak esomeprazol wpływa na aktywność DDAH1?

W przeprowadzonym badaniu naukowcy przetestowali hipotezę, że PPI oddziałują z miejscem aktywnym DDAH, blokując metabolizm ADMA. Wcześniej donoszono, że PPI, takie jak omeprazol (Prilosec, Losec) i lanzoprazol (Prevacid), są metabolizowane w organizmie z formy proleku do wysoce reaktywnej formy tiolowej, która in vivo tworzy addukty disiarczkowe z H⁺/K⁺-ATPazą, prowadząc do hamowania pomp protonowych. Wykorzystując testy enzymatyczne, modelowanie molekularne, krystalografię rentgenowską i techniki spektrometrii mas, badacze przetestowali hipotezę i wykazali mechanizm interakcji między prototypowym PPI, esomeprazolem (izomer (S)-(-) omeprazolu), a ludzkim DDAH1.

Badania wykazały, że rekombinowane ludzkie białko DDAH1 może być wydajnie ekspresjonowane w systemie bakteryjnym z dobrą rozpuszczalnością i rozsądną wydajnością (>2 mg/L kultury). Białko można również oczyścić do poziomu pojedynczego pasma przy użyciu kombinacji kolumny sepharozy GST i chromatografii wymiany jonowej. Analiza proteomiczna przy użyciu spektrometrii mas MALDI TOF/TOF potwierdziła tożsamość ludzkiego DDAH1 w odniesieniu do numeru dostępu Uniprot O94760 (EC:3.5.3.18) z 285 resztami aminokwasowymi i masą cząsteczkową 31,101 kDa. Pomimo obliczonej masy cząsteczkowej, analiza SDS-PAGE pokazuje, że DDAH1 migruje około 36 kDa, co jest zgodne z danymi literaturowymi. Testy biochemiczne wykazały, że oczyszczone DDAH1 jest enzymatycznie aktywne i metabolizuje ADMA w sposób zależny od stężenia, generując cytrulinę jako produkt. Dodatkowy test wykorzystujący sztuczny substrat (SMTC), który ma podobieństwo strukturalne do ADMA, również pokazuje, że rekombinowane ludzkie DDAH1 jest aktywne w metabolizowaniu SMTC do uwolnienia metanotiolu (CH₃-SH) jako produktu.

Aby sprawdzić, czy esomeprazol hamuje aktywność DDAH1, przeprowadzono najpierw test bezkomórkowy, w którym rekombinowane ludzkie DDAH1 inkubowano z ADMA w obecności lub bez esomeprazolu (1-100 µM). Badanie wykazało, że esomeprazol w sposób zależny od dawki hamuje aktywność enzymatyczną DDAH1. Wynik ten został potwierdzony w teście komórkowym, w którym komórki śródbłonka naczyniowego traktowano esomeprazolem lub kontrolą przez 24 godziny przed pomiarem stężenia ADMA. Dane wskazują, że esomeprazol promuje akumulację ADMA poprzez zakłócenie aktywności DDAH1 w metabolizowaniu endogennego substratu. Jak oczekiwano, podwyższenie poziomu ADMA w odpowiedzi na esomeprazol skutkowało upośledzeniem produkcji NO przez komórki śródbłonka naczyniowego.

Czy struktura DDAH1 ulega zmianie pod wpływem esomeprazolu?

Struktura holo-DDAH1 została określona metodą podstawienia molekularnego (MR) przy użyciu struktury ludzkiego DDAH1 o rozdzielczości 2.0 Å (kod PDB 2JAJ) jako modelu wyszukiwania. Końcowa struktura składa się z dwóch niezależnych cząsteczek w jednostce asymetrycznej, cząsteczki A obejmującej reszty Ala9 – Lys282 i cząsteczki B obejmującej reszty Ala1 – Lys282. Cząsteczka B ma również pięć dodatkowych reszt przyłączonych do N-końca z sekwencją (-4)GPLGS(0) odpowiadającą łącznikowi między miejscem pre-scission GST a miejscem restrykcyjnym BamH1 wektora pGEX-6P-1, miejscem, w którym został wstawiony dojrzały ludzki gen DDAH1.

W początkowych mapach gęstości elektronowej holo-DDAH1 Fo-Fc obliczonych po MR zaobserwowano duże piki gęstości resztkowej w pobliżu reszty cysteiny miejsca aktywnego (Cys273). Po kilku rundach udokładniania z phenix.refine, gęstość resztkowa Fo-Fc pozostała i rozdzieliła się na duży pik przyłączony do atomu Sγ Cys273, otoczony trzema dodatkowymi pikami, dając w przybliżeniu tetraedryczną stereochemię. Skanowanie wzbudzenia rentgenowskiego na drugim krysztale holo-DDAH1 z tej samej kropli krystalizacyjnej wykazało obecność jonów metali (Fe przy 6385 eV i Zn przy 8637 eV) w przybliżonym stosunku 70:30 Zn:Fe.

Badania dokowania molekularnego, kierowane odkryciem, że esomeprazol hamuje aktywność enzymatyczną DDAH1, zostały przeprowadzone przy użyciu ICM-Pro. W połączeniu z obserwowanym gromadzeniem się gęstości elektronowej przy Cys273 po namoczeniu kryształu, sugerowało to, że możliwa jest kowalencyjna interakcja między łańcuchem bocznym Cys273 DDAH1 a grupą tiolową zizomeryzowanego esomeprazolu. Chociaż niekowalencyjne dokowanie nietkniętego esomeprazolu do kieszeni katalitycznej DDAH1 daje pozy, które są energetycznie rozsądne, lokalizacja związanego PPI była niezgodna z obserwowaną gęstością elektronową przyłączoną do atomu Cys273 Sy.

Czy esomeprazol modyfikuje DDAH1 na poziomie molekularnym?

Badania spektrometrii mas wykazały, że miejsce aktywne DDAH1 ma więcej modyfikacji w obecności esomeprazolu niż w kontroli z samym DDAH1. Kwantyfikacja MS1 Skyline ujawniła, że występuje zwiększona modyfikacja peptydów zawierających resztę Cys273 zarówno dla -2 Da, jak i +29,9979 Da. Jednak wszystkie inne peptydy DDAH1 wykazują podobny rozkład obszaru pod krzywą (AUC) w próbkach traktowanych esomeprazolem i kontrolnych. Badanie ESI/MS profilu masy nienaruszonych cząsteczek DDAH1 z i bez leczenia esomeprazolem potwierdziło modyfikację enzymu jedną lub dwoma cząsteczkami esomeprazolu, których ilość wzrastała wraz ze wzrostem stężenia leku. Dokładne pomiary masy pozwoliły określić, że masa trzech protonów i jednego atomu tlenu zostaje utracona po kowalencyjnej reakcji jednej cząsteczki esomeprazolu z cysteiną w DDAH1. Obserwacja ta została potwierdzona eksperymentem miareczkowania wolnych tioli, który wykazał zmniejszenie liczby niezreagowanych tioli w próbkach traktowanych esomeprazolem w porównaniu z kontrolą tylko z DDAH1.

Dwupłatowy charakter obserwowanej resztkowej gęstości elektronowej w strukturach namoczonych esomeprazolem jest intrygujący. Po izomeryzacji proleku esomeprazolu wolna grupa tiolowa jest przyłączona do podstawionego pierścienia pirydyniowego przez grupę metylową, ale kształt gęstości sugeruje rozgałęzienie w atomie, który jest kowalencyjnie przyłączony do atomu Sy cysteiny. Gęstość mogłaby być wyjaśniona przez rotację domniemanego wiązania S-S i nieporządek przyłączonego ligandu. W połączeniu z umiarkowaną obfitością kowalencyjnie związanego ligandu opartą na nienaruszonym DDAH1 ESI-MS, możliwe jest, że tylko siarka i grupa metylowa są widoczne w dwóch alternatywnych konformacjach, a reszta ligandu jest zagrzebana w strukturze.

Miareczkowanie wolnych grup tiolowych DDAH1 przy użyciu odczynnika Ellmana również wspiera dane krystalograficzne i spektrometrii mas dotyczące kowalencyjnego wiązania leku z resztami cysteiny w DDAH1. Badanie miareczkowania wykazało, że DTNB ma większą liczbę wolnych tioli dostępnych do wiązania w DDAH1 wolnym od esomeprazolu w porównaniu do enzymu traktowanego esomeprazolem. Jednak umiarkowana redukcja liczby wolnych tioli po dodaniu esomeprazolu w połączeniu z danymi krystalograficznymi i spektrometrii mas sugeruje, że tylko jedna lub dwie reszty cysteiny są zajęte przez esomeprazol. Ilościowo, liczba tioli DDAH1 w kompleksie DDAH1/esomeprazol niedostępnych dla DTNB, obliczona z kontroli bez inhibitora, była około 18% poniżej enzymu DDAH1 wolnego od inhibitora, co odpowiada około 1 na 6 modyfikacji tioli na cząsteczkę DDAH1.

Czy zahamowanie DDAH1 tłumaczy ryzyko zdarzeń sercowo-naczyniowych?

Warto podkreślić, że proleki takie jak PPI wymagają protonowania azotu pirydyny i imidazolu podczas izomeryzacji. Chociaż można się spodziewać, że będzie to zachodziło dość łatwo w warunkach niskiego pH w żołądku, w warunkach eksperymentów spektrometrii mas (które są bliskie neutralnego pH), te kroki protonacji mają być poważnie ograniczone. Dlatego skromny kompleks DDAH1/esomeprazol zaobserwowany w naszym badaniu spektrometrii mas mógł być pod wpływem przewidywanych różnic w warunkach in vitro i in vivo. Niemniej jednak, badanie pokazuje, że zwiększenie stężenia esomeprazolu zwiększa obfitość kompleksu lek-enzym z około 5% przy 100 μM do prawie 50% przy 1 mM. Chociaż ten stopień zaangażowania między DDAH1 a esomeprazolem może być wystarczający, aby ograniczyć aktywność enzymatyczną w utrzymaniu zdrowia sercowo-naczyniowego, możliwe jest przewidywanie wyższych interakcji in vivo po długotrwałym stosowaniu PPI i optymalnych warunkach izomeryzacji, które sprzyjają bardziej wydajnemu tworzeniu disiarczkowych wiązań. W tych warunkach stosowanie PPI ma zwiększać ryzyko chorób nerek, naczyniowo-mózgowych i/lub sercowo-naczyniowych, szczególnie gdy uważa się, że “rezerwa DDAH” jest wyczerpana. Warto zauważyć, że pacjenci, którzy wydają się być narażeni na większe ryzyko sercowo-naczyniowe z powodu długotrwałego stosowania PPI, to ci, którzy mają już niestabilne zespoły wieńcowe i prawdopodobnie wyczerpali swoją rezerwę DDAH lub NO.

ADMA jest czynnikiem ryzyka upośledzenia funkcji poznawczych, progresji przewlekłej choroby nerek (CKD), dysfunkcji naczyniowej i śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych. Jako endogenny inhibitor śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS), podwyższone poziomy ADMA zmniejszają produkcję tlenku azotu (NO), promując skurcz naczyń i upośledzając przepływ krwi do ważnych tkanek, w tym mózgu, nerek i serca. Ponadto podwyższony poziom ADMA jest związany z rozprzęganiem eNOS, zwiększonym stresem oksydacyjnym i dysfunkcją naczyniową. Badania kliniczne wykazały, że ADMA w osoczu jest niezależnym predyktorem poważnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, takich jak zawał serca i udar mózgu, a także CKD i patologii naczyń mózgowych.

Szlak DDAH1 jest patofizjologicznie zaangażowany w układy nerkowy, sercowo-naczyniowy i ośrodkowy układ nerwowy, a jego zahamowanie przez PPI, takie jak esomeprazol, może powodować podwyższenie krążącego i tkankowego poziomu ADMA, hamując produkcję NO. Niskie poziomy NO są związane ze sztywnością naczyń, co może skutkować głównymi czynnikami ryzyka chorób poznawczych, nerkowych i sercowo-naczyniowych. Wzrost ADMA o 20-30% (podobny do tego, co zaobserwowano w badaniach komórkowych przy klinicznie istotnych stężeniach esomeprazolu) wiąże się z 30% wzrostem ryzyka poważnych zdarzeń sercowo-naczyniowych.

Niektóre badania nie wykazały różnicy w krążących poziomach ADMA między użytkownikami PPI a osobami niestosującymi tych leków. Ważne jest jednak, aby zdawać sobie sprawę, że badania te, podobnie jak inne badania retrospektywne, podlegają potencjalnym czynnikom zakłócającym. Na przykład w badaniu opartym na społeczności, o którym donosi Tommasi i wsp., brak związku między stosowaniem PPI a ryzykiem sercowo-naczyniowym jest prawdopodobnie pod wpływem niemożności weryfikacji ważnych zmiennych, takich jak samodzielnie zgłaszana ekspozycja na leki. Jest to szczególnie ważne, ponieważ badane osoby to seniorzy w wieku do 85 lat. Co ciekawe, badanie in vitro przeprowadzone przez tych samych autorów wykazało znaczne hamowanie DDAH1 przez PPI. Warto zauważyć, że hamowanie było zależne od czasu, a resztkowa aktywność DDAH stopniowo zmniejszała się po inkubacji z każdym z PPI, które są teraz w szerokim użyciu klinicznym. Podobnie, brak korelacji między ekspozycją na PPI a poziomami ADMA w osoczu w badaniu Kruszelnicka i wsp. mógł być zakłócony przez krótszy czas stosowania PPI (≥1 miesiąc). W badaniu elektronicznych zapisów zdrowotnych, które analizowało bazę danych 2,9 miliona notatek pacjentów, zaobserwowano znaczący związek między stosowaniem PPI a chorobą sercowo-naczyniową tylko wtedy, gdy czas ekspozycji na lek wynosił 12 miesięcy lub dłużej.

Podsumowując, inhibicja DDAH1 przez klinicznie istotne stężenia PPI, takie jak esomeprazol, zmniejsza metabolizm ADMA i prowadzi do upośledzenia produkcji NO w komórkach śródbłonka naczyniowego. Mechanizm ten może wyjaśniać, przynajmniej częściowo, związek stosowania PPI z chorobami nerek, naczyniowo-mózgowymi i sercowo-naczyniowymi. Dane uzyskane w badaniu sugerują, że lekarze powinni nadzorować pacjentów poddawanych długotrwałej terapii PPI, zwłaszcza tych z grupy ryzyka chorób naczyniowo-mózgowych, nerkowych i/lub sercowo-naczyniowych. Przyszłe badania przedkliniczne i kliniczne powinny ocenić możliwe korelacje między stosowaniem PPI a poziomami ADMA/NO w modelach zwierzęcych oraz u pacjentów z grupy ryzyka.

Podsumowanie

Inhibitory pompy protonowej (PPI), powszechnie stosowane w leczeniu schorzeń żołądkowo-przełykowych, mogą nieść ukryte ryzyko dla układu sercowo-naczyniowego. Najnowsze badania wskazują, że długotrwałe stosowanie tych leków, szczególnie u osób starszych, może zwiększać ryzyko demencji, niewydolności nerek oraz poważnych zdarzeń sercowo-naczyniowych, takich jak udar mózgu i zawał serca. Naukowcy odkryli, że PPI hamują aktywność enzymu DDAH1, który metabolizuje asymetryczną dimetyloargininę (ADMA) – endogenny inhibitor syntazy tlenku azotu. Hamowanie DDAH1 prowadzi do akumulacji ADMA, co z kolei zmniejsza produkcję tlenku azotu i upośledza funkcję naczyniową.

Badania z wykorzystaniem esomeprazolu wykazały, że lek ten wiąże się kowalencyjnie z miejscem aktywnym DDAH1, modyfikując reszty cysteiny enzymu. W warunkach laboratoryjnych esomeprazol w sposób zależny od dawki hamował aktywność DDAH1, prowadząc do wzrostu poziomu ADMA i obniżenia produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka naczyniowego. Analiza strukturalna metodą krystalografii rentgenowskiej oraz spektrometrii mas potwierdziła mechanizm molekularny tej interakcji, pokazując, że po izomeryzacji esomeprazol tworzy wiązanie disiarczkowe z kluczową resztą cysteiny w miejscu aktywnym enzymu.

Podwyższony poziom ADMA jest uznanym czynnikiem ryzyka upośledzenia funkcji poznawczych, przewlekłej choroby nerek, dysfunkcji naczyniowej i zwiększonej śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych. Wzrost ADMA o dwadzieścia do trzydziestu procent wiąże się z trzydziestoprocentowym wzrostem ryzyka poważnych zdarzeń sercowo-naczyniowych. Mechanizm ten może wyjaśniać obserwowany w badaniach epidemiologicznych związek między długotrwałym stosowaniem PPI a zwiększonym ryzykiem chorób nerek, naczyniowo-mózgowych i sercowo-naczyniowych. Szczególnie narażeni są pacjenci z już istniejącymi niestabilnymi zespołami wieńcowymi, którzy prawdopodobnie wyczerpali swoją rezerwę DDAH lub tlenku azotu. Dane te sugerują konieczność ostrożnego nadzorowania pacjentów poddawanych długotrwałej terapii PPI, zwłaszcza tych z grupy wysokiego ryzyka sercowo-naczyniowego.